我n近年来，干细胞移植已广泛应用于中枢神经系统损伤的治疗。干细胞还没有特化，有可能成为人体内的各种特化细胞，因此有治疗多种中枢神经系统疾病的潜力。24神经元和神经胶质细胞可以从胚胎干细胞(ESCs)、间充质干细胞(MSCs)、神经干细胞(NSCs)、神经干/祖细胞(NSPCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)等干细胞中成功生成。6，7，27，39，43NSCs具有自我复制能力和多向分化潜能，是干细胞移植治疗中具有吸引力的靶点。18许多研究报道，在啮齿动物和非人灵长类动物脊髓损伤模型中，NSC移植促进了脊髓损伤(SCI)后神经功能的恢复。例如，McDonald等人在创伤性损伤后9天将神经分化的小鼠ESCs移植到大鼠脊髓中。作者观察到移植的ESCs分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元，从而促进损伤大鼠脊髓的恢复。26此外，据报道，移植的NSCs可以分泌各种神经营养因子和细胞因子，促进轴突再生和髓鞘形成。23，46然而，外源性NSC移植治疗SCI仍存在一系列关键问题，包括细胞相容性和排斥反应、损伤脊髓微环境改变导致移植的NSC不完全分化、异常疼痛等。12因此，旨在增强内源性神经干细胞(ENSCs)再激活和动员的实验策略已经出现，并可能导致治疗中枢神经系统疾病的新治疗方法。32在哺乳动物胚胎和成年动物中，ENSCs均存在于大脑皮层、侧脑室、海马、纹状体和脊髓中央室管膜区。21，31ENSCs具有与所有NSCs相同的生物学特征，包括自我更新和分化为神经元和星形胶质细胞的能力。
甲基强的松龙(MP)是目前美国食品和药物管理局批准用于治疗急性脊髓损伤患者的类固醇之一。1研究表明，在SCI动物模型中，MP通过减少炎症细胞因子/趋化因子和自由基的产生，抑制脂质过氧化，从而抑制各种炎症细胞类型的激活和增殖。7也有研究表明，MP可抑制脊髓损伤后ENSCs和少突胶质细胞的增殖和迁移。27然而，这些研究大多是在大鼠或小鼠或其他啮齿动物身上进行的，或者是从这些动物身上分离出来的细胞。由于啮齿类动物与灵长类动物在中枢神经系统、生理、免疫系统、炎症分子机制等方面存在显著差异，因此在非人灵长类动物模型中研究MP对SCI的影响至关重要。
在本研究中，我们首先在食蟹猴身上建立了非人灵长类动物脊髓损伤模型。然后，我们评估了脊髓损伤后ENSCs的增殖情况，以及MP治疗对脊髓ENSCs增殖的影响，以在非人灵长类动物模型中验证MP治疗对脊髓损伤的影响。
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道德声明
所有动物实验均由中山大学(中国广东广州)脊髓损伤研究所批准，并按照1964年《赫尔辛基宣言》及其后来修订中概述的伦理标准进行。
食蟹猴SCI模型的建立
健康食蟹猴共14只(猕猴属fascicularis)(男女比例1:1;年龄4-5岁;重4.8-5.6 kg)购自蓝岛生物科技有限公司。动物育种和手术在蓝岛生物科技有限公司实验基地进行。动物被安置在一个温度为24°C±4°C，相对湿度为50%±10%的房间里，12小时/12小时的明暗循环。在整个研究过程中，每天9点给动物喂食两次商业饮食我和两点点给了他们饮用水随意．
8只食蟹猴腹腔注射10%戊巴比妥(300 mg/kg)麻醉。在麻醉诱导10分钟后，将动物固定在一块板上去除背部毛发。常规碘消毒皮肤后，通过背部切口进行T-10水平胸椎板切除术。用微剪取出T-10椎板，暴露硬脑膜。使用NYU MASCIS冲击器(50 mm × 50 g)损伤T-10脊髓。SCI模型建立成功的迹象如下:尾部痉挛性摆动，后肢和身体的回缩和颤动，随后出现后肢痉挛性瘫痪。手术后，动物被放置在22°C的单独笼子里，并用加热垫加热身体。术后3天内静脉注射青霉素(20000 U/kg)，每天2次，预防感染。轻柔按摩膀胱，并对尿道出血的动物增加抗生素剂量。
将8只SCI食蟹猴随机分为SCI组(n = 6)和MP组(n = 2)， MP组的2只动物在SCI后立即静脉注射MP (30 mg/kg)。30分钟内静脉滴注MP。另外6只食蟹猴，仅在T-10水平行胸椎板切除术，并进行车辆输注，作为对照。所有动物在死亡前静脉滴注5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU) (50 mg/kg/day) 3天。由于动物数量有限，实验分两个阶段进行。首先，评估脊髓损伤组脊髓室管膜细胞在脊髓损伤后3、7、14天的增殖情况，确定室管膜细胞增殖率最高的时间。为了评估MP组室管膜细胞的增殖情况，在室管膜细胞增殖率最高时，对脊髓室管膜细胞进行解剖。
组织病理学
腹腔注射10%戊巴比妥(300 mg/kg)诱导麻醉后，经心脏灌注生理盐水(500 ml)，再灌注4%多聚甲醛(200 ml)。将损伤的脊髓段连同上段3mm和下段3mm切开，在4%多聚甲醛(20ml)中固定24小时。然后，将脊髓节段转移到30%蔗糖溶液中，在4°C下孵育过夜。石蜡包埋组织按5 μm厚度横切取切片。组织切片用H和E染色，在尼康光镜下检查。小肠切片进行免疫组化染色。
免疫组织化学染色
石蜡切片在培养箱中58°C干燥过夜。常规二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，组织切片在3% H中孵育2O2在37°C下冲洗10分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次5分钟。组织用2 mol/L HCl在室温下变性30分钟，滤纸干燥，0.1 mol/L硼酸钠(pH 8.5)中和10分钟。用滤纸烘干后，用PBS冲洗3次10分钟。然后用0.5% Triton X-100穿透细胞膜30分钟。将组织切片在37℃的山羊血清中封闭10分钟，在4℃黑暗的一抗中孵育过夜，用PBS洗涤3次5分钟。然后，组织切片用生物素化二抗在37°C孵育30分钟，用PBS洗涤3次5分钟。蒸馏水冲洗后，组织切片H & E染色，脱水，干燥，密封。组织在显微镜下检查并拍照。在显微镜下评估brdu阳性细胞的增殖(尼康;放大倍率×100)每5片。
免疫荧光染色
组织切片在冷丙酮中固定20分钟，PBS冲洗3次5分钟，用3%双氧水处理。将组织切片在37℃山羊血清中封闭30分钟，在4℃黑暗环境中加入50 μl的一抗巢蛋白(1:200)孵育过夜，用PBS洗涤3次5分钟。用PBS代替第一个抗体作为阴性对照。组织切片用山羊抗小鼠IgG-FITC(1:100)在37℃孵育30分钟，PBS洗涤3次5分钟。组织样本在显微镜下检查(放大倍率×400)并拍照。巢蛋白阳性细胞计数在5张载玻片上。使用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics)测定中央管周围室管膜细胞内巢蛋白的整体光密度值(n = 2,5张/只)。
统计分析
采用SPSS 19.0版统计软件(IBM Corp.)进行统计分析。所有数据均以均数±标准差表示。采用单因素方差分析后Tukey-Kramer多重比较后验分析三组间差异，两组间差异比较采用独立样本t检验。p < 0.05为有统计学意义。
结果
SCI后的组织病理学改变
对照和脊髓损伤动物脊髓标本的组织病理学结果显示在图1．对照组动物的脊髓组织致密且正常(图1左)。脊髓损伤组脊髓损伤位于脊髓中心的背侧。未受影响的白质局限于侧侧和腹侧。脊髓组织轻度损伤，结构破坏和坏死囊肿(图1右)。
对照组和脊髓损伤动物的脊髓组织病理学。对照组脊髓结构致密且正常。脊髓损伤组脊髓损伤位于脊髓中心的背侧。H & E，原始放大倍率×100。彩色图片只在网上提供。
小肠中brdu阳性黏膜上皮细胞
静脉注射BrdU (50 mg/kg) 3 d后解剖SCI动物小肠组织。大部分(> 80%)小肠黏膜上皮细胞BrdU阳性，细胞核棕色染色(图2)．
脊髓损伤动物小肠黏膜上皮的BrdU免疫组化染色。大部分(> 80%)小肠黏膜上皮细胞呈BrdU阳性，棕核染色。原始放大×100。彩色图片只在网上提供。
脊髓中的巢蛋白阳性室管膜细胞
对照组和脊髓损伤大鼠脊髓解剖，进行nestin免疫荧光染色。如图3，光镜下观察中央管周围巢蛋白阳性室管膜细胞。对照组和SCI动物的室管膜细胞都是ENSCs或神经前体细胞(NPCs)。然而，SCI动物的室管膜细胞比对照动物的室管膜细胞表现出更强的巢状染色。脊髓损伤动物的积分光密度值分别为32328±2291.3、40812±1428.4、34736±2128.5，明显高于正常对照组(24091±2240.2)(p < 0.05)。
对照组室管膜细胞Hoechst染色和nestin免疫荧光染色(得了)及SCI (D-F)动物。光镜下观察中央管周围巢蛋白阳性室管膜细胞。对照组和SCI动物的室管膜细胞都是ENSCs或npc。然而，脊髓损伤动物的室管膜细胞表现出比对照动物更强的巢状蛋白染色。原始放大×400。彩色图片只在网上提供。
SCI动物的brdu阳性室管膜细胞
BrdU染色局限于室管膜细胞核。对照组脊髓中央管周围可见分散的brdu阳性室管膜细胞。脊髓损伤后3,7,14天，在脊髓中央管周围观察到更多的brdu阳性室管膜细胞(图4)．脊髓损伤后第3天(11.5±6.4)、第7天(16.3±8.4)、第14天(9.4±5.4)，中央管周围brdu阳性室管膜细胞数量明显高于对照组(3.2±1.2)。
对照动物室管膜细胞BrdU免疫组化染色(一个)和SCI动物在第3天(B)， 7 (C)及14 (D)．这种染色局限于室管膜细胞核。对照组脊髓中央管周围可见分散的brdu阳性室管膜细胞。在脊髓损伤后第3、7和14天，脊髓中央管周围观察到更多的brdu阳性室管膜细胞。原始放大×400。彩色图片只在网上提供。
脊髓灰质腹角和背角的巢状蛋白/ brdu阳性细胞
脊髓损伤后第3、7、14天，脊髓损伤组右腹角(28.5±5.8、29.7±10.3、20.9±10.1)和背角(45.9±20.9、51.5±10.3、48.6±7.2)的巢蛋白阳性细胞数量明显高于对照组右腹角(15.5±7.3)和背角(34.6±11.5)的巢蛋白阳性细胞数量(图5而且表1)．同样，在脊髓损伤后第3、7、14天，脊髓损伤组腹角(31.5±9.82、29.3±12.65、26.4±8.08)和背角(55.9±15.9、61.5±9.6、53.6±15.2)的brdu阳性细胞数量也明显高于对照动物腹角(19.5±8.1)和背角(41.5±13.5)的brdu阳性细胞数量(图6而且表2)．
脊髓灰质腹角和背角的巢蛋白阳性细胞。脊髓损伤组右腹角和背角巢蛋白阳性细胞数(C和D)显著高于对照动物的腹角和背角(A和B)．原始放大×100。彩色图片只在网上提供。
对照组和脊髓损伤组猴子腹角和背角灰质巢蛋白阳性细胞数量
| 灰质 | 对照组 | 科学组 | ||
|---|---|---|---|---|
| 第三天 | 第七天 | 第14天 | ||
| 腹侧角 | 15.5±7.3 | 28.5±5.8＊ | 29.7±10.3＊ | 20.9±10.1 |
| 背角 | 34.6±11.5 | 45.9±20.9 | 51.5±10.3＊ | 48.6±7.2＊ |
与对照组比较p < 0.05(方差分析后采用Tukey-Kramer多重比较后检验)。
脊髓灰质腹角和背角的brdu阳性细胞。脊髓损伤组右侧腹角和背角brdu阳性细胞数(C和D)显著高于对照动物的腹角和背角(A和B)．原始放大×100。彩色图片只在网上提供。
SCI和MP组腹角和背角Nestin/ brdu阳性细胞
为了评估MP组室管膜细胞的增殖情况，在室管膜细胞增殖率最高时，将脊髓室管膜细胞进行解剖。基于上述结果，我们比较了SCI组和MP组在SCI后第7天的nestin/ brdu -双阳性细胞。我们的数据表明，MP输注显著减少了腹角和背角的巢状蛋白/ brdu阳性细胞的数量(图7)．
脊髓损伤和MP动物脊髓腹角和背角内Nestin/ brdu -双阳性室管膜细胞。与SCI组相比，MP组nestin/ brdu -双阳性室管膜细胞数量明显减少。*与SCI组比较p < 0.05。
讨论
脊髓损伤因其高发病率和高发病率给公共卫生带来了巨大的挑战，目前尚无令人满意的治疗方法。17在脊髓损伤的治疗中，干细胞移植已被尝试过多种方法。近年来，ENSCs在中枢神经系统损伤修复中的作用已被广泛研究。9，45目前已经证实SCI伴随显著的细胞凋亡和基因转录改变。4在高等脊椎动物中，如猴子和人类，轴突再生非常有限，脊髓损伤通常导致病变下方永久瘫痪。相比之下，较低等的脊椎动物，如小鼠和大鼠，在几周内就表现出强大的轴突再生和功能恢复。25造成这种现象的原因有:1)神经干细胞形成的神经元再生能力有限;22) SCI产生多种抑制神经元生长的因子;223)脊髓损伤后，许多胶质细胞类型被招募到病变部位，形成胶质瘢痕，这是轴突生长的抑制成分。34不幸的是，目前还没有针对高等灵长类动物脊髓损伤的有效治疗方法。最近的一项研究表明，恒河猴NSCs作为存在于大脑脑室下区的干细胞亚群，可以在脊髓损伤后存活并分化为神经元，促进功能恢复;29另一项研究表明，nsc衍生的神经元可能通过轴突的脱髓鞘而有效地恢复功能，并补偿死亡的神经元。11这些结果表明，NSCs具有分化为神经元和胶质细胞的多能性，将NSCs移植到损伤脊髓可能为治疗脊髓损伤提供一种新的治疗方法。
在本研究中，我们建立了食蟹猴SCI模型，研究MP对SCI中ENSCs增殖的影响。我们统计了对照组和脊髓损伤组中央管周围巢蛋白阳性室管膜细胞的数量。我们观察到脊髓损伤组中央管周围巢蛋白阳性的室管膜细胞巢蛋白染色明显增强。室管膜细胞是原始的神经上皮细胞，包括NPCs/NSCs，是分布在脑室和脊髓中央管腔的柱状上皮细胞。3.在成年哺乳动物中，脊髓的室管膜细胞增殖能力有限。13SCI诱导室管膜细胞增殖，44增生性室管膜细胞在SCI中表现出NPCs/NSCs的特征。37，42在SCI的成年啮齿动物中，已经观察到室管膜细胞增殖的升高;这些细胞可以迁移到周围组织并分化成星形胶质细胞。16这些数据表明，脊髓中央脑室的NSCs在脊髓损伤的恢复中起着重要作用。我们还观察到SCI组中brdu阳性室管膜细胞在SCI后第3、7和14天比对照组更多。此外，脊髓损伤组右腹角和背角BrdU/巢蛋白双阳性细胞在脊髓损伤后第3、7和14天均有增加，这与先前在啮齿动物脊髓损伤模型中的研究结果一致。8，35因此，关于室管膜细胞，包括npc或NSCs，我们的结果证实了在非人灵长类动物模型中，SCI后室管膜细胞的增殖增加。
一项研究报道SCI诱导成年小鼠ENSCs增殖，分离的ENSCs形成典型的神经球并分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。38然而，脊髓损伤后NSCs大多分化为星形胶质细胞，不利于腋窝髓鞘形成，可能导致神经瘢痕，从而阻碍神经束的重建。15由于中枢神经髓鞘和其他抑制机制，成年哺乳动物中枢神经系统的神经元在脊髓损伤后不能自发地再生轴突。10神经元参与突触的形成和神经递质的传递，并在脊髓损伤后表现出神经保护作用;19，41然而，星形胶质细胞对神经系统的影响更为复杂。一方面，它们分泌神经营养和抗炎因子，促进神经元的存活;另一方面，它们也分泌一些促炎因子，加速神经元的凋亡。40Piechota等人报道，神经胶质细胞可能是中枢神经系统中类固醇转录作用的主要目标，33最近的研究结果表明，内源性神经类固醇(如异孕烯醇酮)可以保护神经元免受中风和脑外伤等损伤。5，14然而，类固醇对NSC分化的影响尚不完全清楚。因此，了解类固醇治疗后ENSC增殖和分化的分子机制对SCI的管理很重要。
MP可以抑制各种炎症细胞类型的激活和增殖，从而减少炎症因子和自由基的产生，这是维持轴突生长和再生平衡微环境所必需的。28在我们的研究中，我们评估了MP对脊髓损伤后第7天brdu阳性细胞达到最高水平时室管膜细胞增殖的影响。在脊髓损伤后第7天，我们发现MP组脊髓腹角和背角的nestin/ brdu阳性室管膜细胞比SCI组少。Yu等发现糖皮质激素诱导新生小鼠齿状回ENSCs和未成熟神经元凋亡，影响新生小鼠齿状回发育。47在脊髓损伤小鼠模型中，高剂量MP治疗已被证明可以抑制ENSCs和少突胶质细胞祖细胞的增殖。36少突胶质细胞作为脊髓髓鞘的主要结构，可诱导无髓神经轴突脱髓鞘。脊髓损伤后NSCs优先分化为星形胶质细胞，形成胶质瘢痕，是脊髓损伤后神经再生最重要的抑制因子。20.SCI引起的局部微环境的改变可能是导致这一现象的主要原因，其中分泌了大量的炎症因子，从而促进了星形胶质细胞的分化，诱导NSCs向胶质细胞分化。30.
限制
我们研究的主要局限性是样本量相对较小，尤其是在MP治疗组。因此，未来应在非人灵长类动物中开展基于更大样本量SCI模型的研究。此外，在非人灵长类SCI模型中标记ENSCs，并研究ENSCs在体内的增殖、迁移和分化，将有助于理解MP抑制ENSC增殖的分子机制。
结论
根据目前和以往的研究结果，我们推测MP抑制ENSCs和少突胶质细胞祖细胞的增殖。我们在非人灵长类SCI模型中证明了室管膜细胞增殖的增加，并观察到MP抑制了室管膜细胞的增殖。虽然NSC移植在鼠类模型中已被广泛应用于探索脊髓损伤后功能恢复的策略，但由于NSC移植后难以分离富集、手术费用昂贵、潜在致瘤性等原因，离临床应用还有一段路要走。
致谢
本研究由国家自然科学基金资助(no。U1301223);广州市科技计划项目(no.;201707010273);广东省科技计划项目(no . 2016A020225001、2017A020213024);广东省医学科技研究基金(no.;A2016233);广东省中医药局科研项目(no.;20161233)。
披露的信息
作者报告在本研究中使用的材料或方法或本文中指定的发现没有利益冲突。开云体育世界杯赔率
作者的贡献
构思与设计:沈、叶。数据采集:Ye, Qin, Ma, Chen。数据分析与解释:王。文章起草人:Shen, Ye, Qin, Wang。批判性地修改文章:沈，唐，马，黄，杨，吴。审阅提交的手稿版本:沈、秦、唐、黄、杨、陈。审定稿稿代表所有作者:沈。统计分析:Shen, Ma, Wang, Chen, Chai, Wu。行政/技术/物资支持:唐、王、黄、杨、柴。学习督导:秦、唐、马、黄、阳、柴、吴。
