Glioblastoma(GBM)是最常见的原发性恶性脑肿瘤。尽管有积极的多模式治疗，包括手术、放疗和化疗，但新诊断的GBM患者的中位总生存期仍然很糟糕，只有14-15个月。GBM患者的护理可因治疗开始后几周至几个月内高达45%的GBM患者发生假进展-非病理性的治疗相关变化而进一步复杂化。1传统上，假进展被报道为联合使用替莫唑胺治疗和放疗，尽管也被观察到使用免疫治疗(即检查点抑制剂)。2此外，MGMT启动子甲基化和/或IDH突变的患者特别容易发生假进展。1不幸的是，假进展引起增强造影剂和脑水肿的增加，这在临床和影像学上与真实进展难以区分，从而使GBM患者群体的护理复杂化(图1)．从历史上看，假性进展的诊断最常见的是结合临床和影像学结果，偶尔由活检标本的组织病理学支持。然而，MRI结果是非特异性的，在这种情况下敏感性和特异性较低。此外，脑活检是侵入性的，有相关的风险。因此，迫切需要开发和使用新的非侵入性诊断分析来增强临床和影像学发现。
假进展与真进展的放射学比较。左:轴向t1加权gd增强MR图像显示一名63岁男性在第9周期完成后出现炎性假进展。活检显示坏死伴明显炎症浸润。正确的:轴向t1加权gd增强MR图像显示46岁男性在第9周期的真进展与假进展难以区分。活检显示肿瘤存活，无炎症浸润。
非侵入性诊断工具，如液体活检，有可能彻底改变GBM的管理(图2)．液体活检使用肿瘤生物标志物，如循环肿瘤细胞(CTCs)、外泌体和其他细胞外囊泡，以及在患者体液(如血液、脑脊液和尿液)中发现的无细胞核酸。3.，4与脑活检相比，它具有微创性，并允许实时监测疾病进展。它已经被常规用于各种癌症的疾病监测和检测，包括乳腺癌和结肠癌。5
GBM的液体活检概述。GBM肿瘤细胞产生ev、ctc和细胞游离DNA和RNA，它们不同程度地穿过血脑屏障并进入血液。每一种生物标记物的相当一部分仍留在脑脊液中。这些生物标志物的液体活检样本是脑脊液或血液/血浆，使用各种方法进行分析(例如，液滴数字PCR，全基因组测序，NGS和蛋白质组学)。开云体育世界杯赔率结果数据可用于描述遗传肿瘤的情况，量化治疗反应，并指导个体化治疗方案。由BioRender.com创建。
在GBM中，最近的研究表明，液体生物球蛋白在区分假进展和真进展方面的临床应用。6此外，它还提供了一种可获得的、负担得起的和微创的解决方案，用于监测GBM的临床过程和治疗反应。液体活检有可能在患者出现症状之前发现早期复发。7此外，液体活检可以持续监测治疗反应(通过肿瘤缩小)或治疗耐药性，在任何肿瘤大小的重大变化在影像学上是明显的。7最后，在多项研究中，液体活检已被用于预测GBM患者的无进展和总生存期。8，9
重要的是，液体活检可能会阻止患者接受额外的脑活检，以确定成像变化是否代表假进展或真进展。它还可能取消对额外先进和昂贵的成像方式(即PET)的需求。在个体水平上，血浆或脑脊液样本中特定肿瘤生物标志物的表征可以实现个性化治疗方案，并提供检测早期复发的手段。10因此，液体活检可作为将个体化药物纳入GBM患者治疗的有力工具。
液体活检的选择
在GBM进行液体活检的基础上，存在两个总体策略。第一种方法是检测血浆或脑脊液中的肿瘤特异性物质。这种策略的可行性在于，GBM中血脑屏障(BBB)渗透性的增加允许肿瘤来源的成分外渗，然后可以在血流中检测到。11然而，在含有许多其他细胞类型成分的生物液中检测少量特定肿瘤成分是一个重大挑战。第二种策略包括分析生物液体的大部分成分，以开发针对GBM患者与正常健康捐赠者的特异性签名。对于这一策略，GBM的状态将通过GBM对生物液体的其他成分(例如，循环免疫细胞)施加的影响来间接测量。在接下来的章节中，我们将介绍各种可用于GBM液体活检的生物标记物，以及它们的优点、局限性和未来应用。
细胞外囊泡
细胞外囊泡(EVs)是由所有细胞释放的30nm至10 μm纳米颗粒被膜包裹的物质。4ev由几个亚群组成，包括凋亡小体(500 nm - 5 μm)、大型肿瘤小体(1 - 10 μm)、微囊泡(通常为50-500 nm，最高可达1 μm)和外泌体(30-150 nm)。4外泌体起源于晚期核内体的多泡体中形成的腔内囊泡，而微囊泡和大的癌小体直接从质膜上发芽，凋亡小体通过细胞泡变形成。在GBM中，ev已被证明在全身免疫抑制中发挥作用，12血管生成的诱导，13细胞间的沟通,14促进肿瘤生长和侵袭。15此外，已在血浆、脑脊液、尿液、唾液、眼泪和其他体液中鉴定出ev。4此外，与无细胞核酸相比，ev在结构上相对稳健，易于穿过血脑屏障。11目前用于分离分析ev的技术包括尺寸排除色谱、顺序过滤、差速超离心和密度梯度超离心等。16然而，文献中EV命名的不一致之处比比皆是，不同的分离方法尚未在组间协调或标准化。开云体育世界杯赔率17此外，已发表的关于电动汽车的研究往往受到样本量小的限制。额外的验证研究和精心设计的前瞻性临床试验对于证明强有力的结果相关性和确认患者获益至关重要。18
EV生物分子货物由核酸、代谢物和反映其细胞起源的蛋白质的混合物组成。17在GBM中，遗传异质性导致肿瘤源性ev的可变负载。19因此，肿瘤来源的EV货物已被检查为液体活检的潜在焦点。通过对EV蛋白质组的分析，已经建立了gbm衍生EV的假定分子特征，19，20.RNA的内容,19- - - - - -21基因组甲基化/基因突变，22表面标记。19，23这些方法识别出的重要分子途径包括补体激活/免疫反应，开云体育世界杯赔率20.组织重构/再生,24入侵,25和新陈代谢。26专注于更具体的生物标志物的研究已经确定了EGFRvIII，27PD-L1,12和vWF20.作为潜在的重要标记。这些实验发现中的许多都需要在临床环境中进行验证。由于电动汽车货物的复杂性和异质性，必须开发包含这些发现的综合特征，以进行一致和准确的诊断。有趣的是，这可能是基于ev的液体活检的一个优势，因为针活检通常在检测异质性方面受到限制。28
另外，在没有专门分离和浓缩肿瘤源性EV的情况下分析的大块血浆EV也为设计液体活检提供了有价值的诊断信息。例如，Cilibrasi等人证实，与健康供体相比，GBM患者血浆EVs中补体、炎症和凝血调节因子的蛋白质组学特征存在差异。20.此外，GBM患者的整体血浆EV浓度高于健康供体;这种变化是特异性的GBM相对于脑转移和轴外脑瘤。29重要的是，多组研究表明EV水平在肿瘤切除后下降，在肿瘤复发时再次上升，从而证明了EV在GBM患者临床监测中的实用性。6，29此外，化疗或放疗期间EV水平升高已被证明与较短的总生存期和较早的复发有关。30.最后，这些血浆EV浓度的变化也可用于区分化疗和放疗期间的真进展和假进展。6
光谱特征，如从拉曼光谱和流式细胞仪获得的光谱特征，可能允许快速和直接检测ev。Maas等报道称，在肿瘤切除前口服5-氨基乙酰丙酸可通过流式细胞术检测患者血浆中的GBM ev。31然而，gbm衍生的ev只占血浆样本中发现的ev的少数。23此外，在EV亚群中发现了表面标记物和含量的重要差异，提出了在个体或批量基础上进行EV活检更好的问题。19，23通过流式细胞术免疫分型对大量血浆源性ev进行表征，可以消除分离GBM特异性ev的需要，从而简化GBM中的液体活检。例如，我们的研究小组最近表明，t分布随机邻居嵌入揭示了来自GBM患者与健康供体血浆的ev的独特聚类特征(图3)．我们还使用流式细胞术数据来定义GBM中独特的EV亚群。因此，随着该技术进入临床，利用大量血浆ev的光谱特征可能使液体活检更容易获得和有效。
GBM患者的非肿瘤性血浆EV表型不同于正常供体(ND)。答:几种非肿瘤性EV表面标记物(CD9、CD11b、CD31、CD41a和CD45)的多参数分析和EV大小的测量(侧散射;采用t分布随机邻居包埋(t-distributed stochastic neighbor embedding)，显示出与正常供体相比，GBM血浆ev的聚类特征明显不同。流式细胞仪数据分析的自组织图显示了10种不同的EV种群，用不同的颜色表示。B:热图显示每个种群的相对大小(侧散点)和表面标记物表达水平。C:流式细胞术数据的自组织图显示，与正常供体相比，GBM患者血浆中富集了三种独特的EV群体(Pop0、Pop1和Pop6)。
核糖核酸
rna很有希望作为癌症进展和治疗反应的替代生物标志物。在外周血、脑脊液、唾液和尿液中检测到多种肿瘤相关rna。32，33在GBM中，RNA标记可以在循环无细胞形式的RNA中获得，也可以从循环外泌体、血小板和循环肿瘤细胞(ctc)中提取。19，34，35对于这种gbm相关的rna，主要的候选液体活检样本是外周血-血清浓度高于血浆36和CSF，因为排泄的生物液受到额外的过滤和RNase降解。32，37聚焦超声(FUS)已被证明在动物模型中促进各种脑肿瘤生物标志物的释放，mri引导的FUS已被提出作为一种方式来加强gbm相关rna在人类血脑屏障中的输出。38另外，Ita等人最近的一项研究发现，差异表达的免疫基因GZMB而且抗原血浆和胶质瘤来源的信使RNA (mRNA)呈正相关。39这表明RNA生物标志物的另一种机制是对GBM的免疫反应，从而绕过血脑屏障。
除了蛋白质编码mRNA，转录后调控非编码RNA，如microRNA (miRNA)和环状RNA (circRNA)已被证明是GBM负担的有用标记，因为它们的相对丰度、低分子量和外泌体包装，这可能会减轻它们从中枢神经系统的排出。40，41一些致癌miRNAs，如miR-10b和miR-106a-5p在GBM患者的外周血中浓度较高。42，43当GBM进展时，肿瘤抑制miRNAs，包括miR-29a和miR-485-3p，在循环中减少。44，45在液体活检中发现的其他mirna和环状rna与化疗和放疗的反应相关。46，47早期研究表明，在液体活检中发现的miRNA标记可能在免疫治疗反应预测和监测中具有类似的用途。48值得注意的是，阐明RNA标记物对GBM切除结果的预后影响的大门是敞开的。
到目前为止，GBM的个别RNA标记物的敏感性和特异性较差，阻碍了其临床应用。由多个rna组成的签名，特别是来自CSF液体活检的签名，可能是这个问题的解决方案。49简单地将miR-21与miR-15b的表达相结合，就产生了一种诊断方法，可以区分GBM与原发性中枢神经系统淋巴瘤，敏感性为90%，特异性为100%。50Akers等人发现了一个与GBM肿瘤体积相关的9-miRNA特征，其CSF检测灵敏度和特异性分别为67%和80%。51使用更大的转录组谱(例如，ctc的rna序列)，网络分析可以添加交互组上下文来生成更可靠的签名。52构建更复杂的rna特征，结合本综述其他地方讨论的其他生物分子，可能为GBM提供更好的液体活检分析。
无细胞循环肿瘤DNA
近年来，无细胞循环肿瘤DNA (ctDNA)从GBM细胞中释放出来，并作为一种潜在的液体活检底物引起了人们的兴趣。循环肿瘤DNA主要由凋亡和坏死细胞通过DNAseIL3和caspase激活的DNase脱落，尽管一些研究小组认为巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用也可能起作用。53循环肿瘤DNA主要由大约140-180个碱基对大小的片段组成，54这接近核小体的147 bp大小。循环肿瘤DNA之前已被探索作为CNS以外癌症的生物标志物。Bettegowda等人在一项涉及640名不同肿瘤类型患者的研究中报道，在超过75%的晚期乳腺、膀胱、黑色素瘤和肝细胞恶性肿瘤患者的血液中检测到ctDNA，而在原发性脑肿瘤患者中检测到ctDNA的比例不到50%。55这种低水平的血浆ctDNA是否源于血脑屏障仍是一个有争议的问题，因为一项研究发现血脑屏障的破坏对GBM细胞脱落ctDNA的能力没有影响，54而其他研究表明血脑屏障的破坏会增加CSF/血浆中的ctDNA，并可能增加检测特异性。53，56循环肿瘤DNA也具有不到2小时的半衰期，因此需要快速处理样本进行分析。57
尽管存在这些技术限制，ctDNA仍是GBM诊断和预后信息的潜在可靠来源。与健康对照相比，GBM患者血浆和脑脊液中ctDNA浓度较高。3.术前ctDNA浓度高与GBM无进展生存期较低和总体生存结局较差相关。58Kang等人最近的一项荟萃分析发现，ctDNA检测对GBM的总诊断敏感性和特异性分别为0.69和0.98。59此外，一些研究发现ctDNA水平与肿瘤病理特征(如巨噬细胞密度和肿瘤血管大小)以及肿瘤大小相关。53因此，ctDNA水平可以作为复发的早期检测，60- - - - - -62一种追踪治疗反应的方法，57以及一种区分假进展和真进展/复发的方法。3.，57
重要的是，ctDNA分析可以揭示肿瘤特异性突变，使GBM肿瘤突变地形的特异性和微创研究成为可能。突变类型包括点突变、染色体和微卫星变化、启动子序列突变/高甲基化和基因-基因融合。通常受影响的基因包括叔启动子,61，63EGFRvIII，64TP53，60管理，65PDGFRA，65，66PTEN，60，62，65IDH，65，67PIK3CA，55，60，65而且BRAF，55，65等等。Palande等人鉴定了ctDNA中可识别的基因-基因融合，融合了酪氨酸激酶，因此可能被激酶抑制剂(如伊马替尼和索拉非尼)靶向。66尽管有创穿刺活检可能无法捕获GBM肿瘤的遗传异质性，ctDNA已被证明可以检测活检样本中未发现的突变。3.，62
循环肿瘤DNA在脑脊液中始终比在血液中更容易识别，67脑脊液ctDNA的诊断准确率较高。59虽然通过腰椎穿刺收集脑脊液比抽血更具侵入性，但与手术切除或活检相比，它的侵入性较小，容易发生并发症。有趣的是，Mair等人确定线粒体DNA (mtDNA)是液体活检中潜在的替代DNA来源;mtDNA可在尿液、血清和脑脊液中检测到。54在收到样本后，使用各种方法分析ctDNA样本中的突变开云体育世界杯赔率64，65主要采用甲基化聚合酶链反应(PCR)、数字液滴PCR和下一代测序(NGS)，这三种方法分别提高了液体活检对GBM的敏感性。18然而，分离ctDN开云体育世界杯赔率A的方法在不同的机构之间有所不同，这可能会导致结果和诊断准确性的差异。59因此，ctDNA分离方法的标准化将是至关重要的，如果它的使用在液体活检成功引入临床。
基于单元的策略
除了血浆生物标志物，循环细胞的检测和量化已被探索作为液体活检的基础。由于GBM中血脑屏障的损害，ctc可能进入血液，并在GBM患者的周围发现。11，68因此，ctc的分离可作为获得GBM基因组信息的直接手段。69然而，ctc的分离是一项困难的技术，分离完成后ctc的低收率会进一步使其复杂化。68此外，涉及ctc的现有研究受到样本量小和使用不同隔离策略的限制，因此无法在研究之间进行准确的比较。18
另外，对外周血中整体细胞群的调查避免了依赖于检测少量ctc或其他单个生物标志物的需要。这种方法的原理基于GBMs产生全身免疫抑制作用的概念，尽管从未离开中枢神经系统。70GBM本身富含单核细胞，这些单核细胞分化为骨髓来源的抑制细胞、非经典单核细胞和M2巨噬细胞。70，71这些细胞然后可以重新进入循环，发挥它们的整体免疫抑制作用。重要的是，Giordano等人证明，与健康供体相比，GBM患者的CD163+单核细胞增加，在残留肿瘤的情况下，CD163/FKBP51s+。71此外，与真进展患者相比，假进展患者的CD163/FKBP51s+单核细胞显著减少。与单核细胞类似，血小板也浸润肿瘤微环境，并能够为GBM的生长提供血管生成因子。这些血小板分化为肿瘤教育血小板，表达更高水平的VEGFR1/2和vWF，这可以进一步作为液体活检检测的基础。72
讨论
GBM中存在多种有前景的液体活检方法，包括基于EVs、核酸、肿瘤来源细胞和循环非肿瘤细胞分析的方法(表1)．在比较各种液体活检方式时，ev比核酸更能穿过血脑屏障，并留在外周循环中。11DNA和RNA在脑脊液中含量较高，并在外周循环中迅速降解，因此需要快速转移和分析患者样本。57因此，聚焦于无细胞肿瘤DNA和RNA的活组织检查使用CSF通常更成功，而基于ev的活组织检查使用简单的抽血就能成功。因此，ev有望用于以血液、血浆或血清为基础的液体活检，其侵入性明显小于腰椎穿刺或肿瘤活检。此外，ev包含大量的生物标志物，包括核酸、代谢物和蛋白质，可用于为每个患者创建“肿瘤特征”。由于GBM肿瘤的异质性，这种特征可能包括单针活检无法检测到的多种突变。EVs的浓度也高于ctc, ctc在外周血中难以分离且罕见。例如，如果一个机构无法获得EV分离设备或在必要的操作期间可以完成CSF收集，则使用基于CSF的核酸或ctc活组织检查可能是谨慎的。无论使用何种方法，如果液体活检要成功地过渡到临床，就需要标准的分离和分析技术。通过精心设计的前瞻性临床试验验证实验结果，将进一步证明基于ev的液体活检对患者的益处。
GBM液体活检发展中生物标志物的选择
| 生物标记/战略类型 | 简要描述 | 的优势 | 限制 | 未来的应用 |
|---|---|---|---|---|
| 细胞外囊泡 | Membrane-encapsulated;30 nm ~ 10 μm纳米颗粒;由所有细胞释放 | 在许多生物流体中发现的;在外周循环中降解缓慢 | EV命名、分离技术的不一致;肿瘤源性ev占血浆ev的少数 | 流式细胞仪特征;EV特征中的生物标记物组合;描述大量EV种群的特征 |
| RNA游离 | 无细胞，循环RNA;多种亚型(如miRNA、circRNA);无细胞形式的RNA以及循环外泌体、血小板和ctc | 在许多生物流体中发现的;对各种rna的上调和下调反应 | 个别RNA标记的敏感性、特异性差;RNase在外周血中的降解 | 聚焦超声促进RNA释放，其他生物标志物进入血液;免疫治疗反应预测、监测;miRNA活检特征 |
| 游离DNA | 无细胞，循环肿瘤DNA;140- 180 bp片段 | 反映GBM异质性的突变;高总特异性(>95%)和取决于分离方法的敏感性(> 60-90%) | 在外周循环中迅速降解(<2小时);脑脊液浓度高于血液 | mtDNA的使用;在医院进行腰椎穿刺活检 |
| 循环肿瘤细胞 | 周围循环中存在肿瘤源性细胞;在血脑屏障受损后进入血液 | 直接从外围取样本进行全细胞测序 | 复杂、耗时的隔离技术;隔离率低 | 改进隔离技术;全细胞测序 |
| 循环的非肿瘤细胞 | 外周循环中存在非肿瘤源性细胞(如单核细胞);由于GBM的存在而改变的性质 | 可以针对多种细胞类型;全血与特定成分分离分析 | 分析技术仍在发展中;具体靶点/细胞类型尚未确定 | 细胞群的简单全血活检;可能的GBM血液特征与多种细胞类型 |
尽管生物标记物特异性液体活检在提供关于个体GBM患者基因型的详细和具体信息方面显示出巨大的前景，但这些技术所需的后续分离和分析可能相当耗时和昂贵。因此，未来的研究将转而寻求开发可用于检测GBM的整体特征，而不是依赖于单个生物标志物的识别。正如我们小组所证明的，血浆EV的免疫表型表征显示了正常健康供体和GBM患者之间的EV群体的差异(图3)．同样，GBM患者白细胞的免疫分型不仅可以作为检测和监测肿瘤大小的策略，而且还提供了关于个体对免疫治疗反应的信息。73其他研究已经开发出分析血清的技术，而不需要进一步分离或鉴定血液成分。Theakstone等人证明了使用光谱学来表征GBM患者的特征，其检测GBM的敏感性和特异性大于88%。74特别是，该策略可以作为GBM的有效的第一筛查工具，因为它不依赖于检测少量特定生物标志物。
虽然这些快速检测策略可能在肿瘤检测和肿瘤负荷评估中发挥更突出的作用，但在设计个性化治疗方案和评估治疗反应时，检测DNA、RNA和肿瘤来源的EV货物变化的替代液体活检策略可能是有益的。事实上，无细胞肿瘤DNA在GBM中表现出优异的敏感性。18，50因此，GBM患者护理的未来可能包括各种液体活检选择的组合，可以根据手头的问题使用。这种多样化的诊断方式最终将允许更离散地描述患者疾病，使用更有效的策略，并改善患者的结果和生活质量。
结论
液体活检为GBM的治疗反应和复发的微创监测提供了一个有前途的途径。虽然必须采取额外的步骤将液体活检带入临床，但原理验证研究和分离方法是有希望的。最终，CSF和/或血浆为基础的液体活检在不久的将来可能成为神经外科医生的武器库中用于GBM患者的治疗和管理的强大工具。
致谢
S.M.B.和D.D.M.由国家普通医学科学研究所(T32 GM65841)和梅奥诊所医学家培训计划的机构培训拨款支持。D.D.M.还得到了美国国家癌症研究所(F30 CA250122)和梅奥诊所再生医学中心的个人奖学金的支持。
披露的信息
作者报告在本研究中使用的材料或方法或本文中指定的发现没有利益冲突。开云体育世界杯赔率
作者的贡献
构思与设计:帕尼，鲍曼，布沙尔。数据采集:Bauman, Aibaidula。数据分析与解释:布查尔、艾拜杜拉。文章起草人:鲍曼，布沙尔，莫尼，艾拜杜拉，辛格。批判性地修改文章:帕尼，鲍曼，布沙尔，莫尼，辛格。审查提交的手稿版本:帕尼，鲍曼，布沙尔，莫尼，辛格。代表所有作者:帕尼批准了手稿的最终版本。统计分析:艾白杜拉。
