Glioblastoma(GBM)是成人最常见的恶性脑肿瘤。尽管标准治疗有所改善，但GBM患者的中位生存时间仅为14个月。1用溶瘤病毒等生物制剂治疗GBM患者已在临床前动物研究和临床中显示出有希望的结果。2 - 4溶瘤病毒是具有复制能力的肿瘤选择性病毒，可导致胶质瘤细胞裂解并随后释放到微环境中。许多溶瘤病毒已在多种癌症的临床试验中进行了测试，或作为单一药物，或与化疗或放疗联合使用。3.，5我们已经开发出溶瘤腺病毒Delta-24-RGD作为治疗GBM的病毒治疗剂。在一期临床试验中，Delta-24-RGD经瘤内给予复发性恶性胶质瘤患者(clinicaltrials.gov标识符NCT00805376);3.治疗后标本的分析表明Delta-24-RGD在肿瘤细胞中复制并诱导抗胶质瘤免疫反应。此外，结果数据显示了潜在的疗效，12%的患者有完整和持久的缓解(>为3.5年)。然而，这些瘤内给药生物疗法的疗效可能因其对大多数肿瘤的分布效率不高而受到限制。6，7因此，迫切需要开发Delta-24-RGD的新交付方法。开云体育世界杯赔率
为了进一步改善试剂的输送，已经探索了干细胞载体。具体来说，骨髓来源的人间充质干细胞(BM-hMSCs)已被用作抗肿瘤药物的细胞载体，包括溶瘤病毒，8，9因为骨髓间充质干细胞在全身注射后具有迁移到各种实体肿瘤的能力。10在过去的10年里，我们和其他人已经在胶质瘤小鼠模型中证明了使用健康供体来源的脑基质干细胞(HD-BM-hMSCs)向肿瘤输送抗肿瘤药物的可行性。11具体来说，我们是第一个证明HD-BM-hMSCs在全身(动脉内)分娩后定位于人类胶质瘤的人。12我们还确定了血小板衍生生长因子- bb的因果作用13以及转化生长因子-β14HD-BM-hMSCs在胶质瘤定位中的作用。最重要的是，我们首次证明携带干扰素-β或Delta-24-RGD的HD-BM-hMSCs在血管内传递可以改善人类胶质瘤动物的生存率，甚至治愈。12，15建立负载抗胶质瘤药物的HD-BM-hMSCs作为治疗胶质瘤的强大治疗剂。
所述研究的基本前提与异体BM-hMSC策略一致。骨髓间充质干细胞可从健康供体获得并用于异体移植。另一方面，BM-hMSCs可以从患者身上获得，并通过自体移植的方式输送回来，从而避免了异体免疫屏障和排斥的可能性。16，17尽管自体bmm - hmscs具有优势，但在何种程度上可以从接受过放射治疗和骨髓抑制化疗的GBM患者的骨髓中获得bmm - hmscs尚不清楚。此外，即使可以获得自体骨髓间质干细胞，也不清楚它们是否能够靶向并将Delta-24-RGD这样的治疗剂递送到脑肿瘤。为了解决这一知识上的差距，我们从复发性高级别胶质瘤患者中分离出BM-hMSCs，并评估它们在注入Delta-24-RGD后感染和根除胶质瘤的能力。
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骨髓间充质干细胞的制备
已接受放射治疗和化疗药物(丙卡嗪、洛莫司汀、长春新碱或替莫唑胺)治疗的患者签署知情同意书，并纳入前瞻性临床方案(表1)．在对复发的肿瘤进行开颅手术之前，将患者置于全身麻醉下，并从髂骨中获得BM抽吸物;如前所述，从这些吸出物中分离和培养BM-hMSCs。18简单地说，从组织池(Sigma-Aldrich)密度梯度分离后产生的界面上收集单个核细胞，在MSC培养基中洗涤一次:α-minimum essential medium (MEM;Mediatech)补充100u /ml青霉素、100mg /ml硫酸链霉素(Flow Laboratories)、2 mM l -谷氨酰胺(Mediatech)和20% (v/v)胎牛血清(FBS;Lonza)。从10ml骨髓抽吸液中提取的单个核细胞在75厘米的培养皿中培养2培养瓶浓度为1-5 × 106/ml在37°C。2-3天后，去除非贴壁(造血)细胞，在MSC培养基中培养贴壁细胞，直到细胞达到约70%合流。通过胰蛋白酶消化(1 ×胰蛋白酶- edta, Invitrogen)释放粘附细胞，传代培养成新的75 cm2培养瓶。在175 cm内，脑转移- hmscs维持为融合的单层2组织培养瓶和传代培养至少3次，然后将细胞置于冷冻储存，冷冻以确保去除残留的造血细胞。所述实验中使用的细胞来自细胞传代3-6。作为阳性对照，从一名从未接受过化疗的健康男性供体髂骨中分离出的临床级BM-hMSCs来自MD Anderson的干细胞移植科。
BM-hMSCs来源患者的特征
| 情况下没有。 | 年龄(岁) | 性 | 病理Dx | 以前的治疗 | 从化疗到收获的时间 | Hb (g / dl) | 白细胞(K /μl) | 血小板(K /μl) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 001 | 58 | 米 | GS | S, rt, TMZ | 2金属氧化物半导体 | 14.8 | 10.8 | 222 |
| 002 | 51 | F | AA | S rt PCV | 18岁 | 13.3 | 4.6 | 182 |
| 003 | 52 | 米 | AA | S, rt, pcv, TMZ | 3金属氧化物半导体 | 14.3 | 5.7 | 224 |
| 004 | 38 | F | “绿带运动” | S, rt, TMZ | 7岁 | 14.6 | 9.5 | 283 |
| 005 | 46 | F | AO | S, rt, TMZ | 14岁 | 11.6 | 4.4 | 334 |
AA =间变性星形细胞瘤;间变性少突胶质瘤;Dx =诊断;GS =胶质肉瘤;PCV =丙卡嗪、洛莫司汀和长春新碱;放射治疗;S =手术;TMZ =替莫唑胺;WBC =白细胞。
脑基质hmscs的特征
使用国际细胞治疗学会(ISCT)间充质和组织干细胞委员会制定的标准将分离的细胞定性为BM-hMSCs，即1)对组织培养塑料的粘附性;2) CD105、CD73、CD90阳性表达，CD34、CD45、CD11b不表达;3)在标准体外分化条件下向成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化的能力。19，20.流式细胞术检测第3-4代CD105、CD73、CD90、CD34、CD45和CD11b的表达标记。
分化的协议
对于脂肪形成，105将细胞镀于12孔培养板，当细胞达到100%合流时，加入成脂诱导培养基(龙沙)，每3天更换一次。3周后用油红o染色。成骨:5 × 104细胞在12孔培养板中培养。24小时后，用成骨诱导培养基(龙沙)诱导分化，每3天更换一次培养基。3周后，细胞用茜素红染色。软骨形成用3 × 10制粒制备细胞球团5细胞置于15 ml聚丙烯管中，并辅以完全的软骨诱导培养基(龙沙)。每3天用新鲜的完全成软骨培养基喂养细胞颗粒。4周后，用10%福尔马林和石蜡包埋固定球团;5 μm切片安装在载玻片上，用藏红花素O对糖胺聚糖进行染色。
肿瘤细胞
U87MG细胞来自American Type Culture Collection。细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的MEM中生长。U87MG- lucneo由B.S. Carter(麻省总医院)提供，如前所述，在含有0.5 mg/ml zeocin的U87MG培养基中生长。21
电子显微镜
细胞样品用含3%戊二醛+ 2%多聚甲醛的溶液固定在0.1 M碳酸钙缓冲液(pH 7.3)中1小时。固定后，用0.1% millipore过滤的酸钠缓冲单宁酸清洗处理，然后用1%缓冲的四氧化锇固定1小时，最后用1% millipore过滤的乙酸铀酰(Sigma-Aldrich)染色。样品在乙醇中脱水，并嵌入到Spurr的低粘度介质中。然后在70°C的烤箱中聚合2天。用Leica Ultracut切片机切割超薄切片，用Leica电子显微镜染色器染色醋酸铀酰和柠檬酸铅，并在80 kV加速电压下使用JEM-1010透射电子显微镜(JEOL USA Inc.)进行检查。使用成像系统AMT软件(Advanced Microscopy Techniques)获取数字图像。
Delta-24-RGD的MSC标记与感染
在体内研究中，BM-hMSCs用绿色荧光蛋白(GFP)转导，该蛋白使用的是复制能力不强的Ad5/F35-CMV-GFP(5型腺病毒，在其E3区含有GFP)绿色荧光蛋白巨细胞病毒启动子基因驱动;如前所述，贝勒医学院病媒发展实验室)。15在3ml无血清MSC培养基中用50个感染多重性(MOIs)处理BM-hMSC单分子层，并在37°C下每10分钟摇一次。1小时后，加入含10% FBS的MSC培养基。
对于Delta-24-RGD感染，将10 - 100个空斑形成单位(PFU)/细胞的病毒原液添加到3ml无血清培养基中。
体外药效试验
Transwell分析使用0.4 μm嵌件(Greiner Bio-One)进行。Delta-24-RGD在50 MOIs时感染BM-hMSCs。感染24小时后，收集细胞，清洗，并在上面的孔中以不同密度的细胞/孔重复，并放置在含有10个的低孔上4U87MG细胞。7天后，使用Vi-Cell XR (version 1.01, Beckman Coulter Inc.)计数存活的U87MG细胞数量。
颅内注射
动物(n = 95)按照机构动物护理和使用委员会的准则被安置和照顾。22对于异种胶质瘤移植，如前所述，通过颅骨导向螺钉移植U87MG或U87MG- lucneo细胞。23小鼠注射5 × 105细胞通过汉密尔顿注射器插入5毫米深。细胞通过微注射泵(0.5 μl/min, Harvard Apparatus)同时植入10只小鼠。12颅内注射病毒时，小鼠注射Delta-24-RGD 5 μl 2次(108PFU)通过导向螺钉，如前所述。23所有动物模型实验的总结描述在补充图1．
颈内动脉注射脑基质hmscs
骨髓间充质干细胞胰蛋白酶化，离心(1500转，5分钟)，10时在MSC培养基中与10%胎牛血清重悬6每100 μl细胞。如前所述，使用30号针向小鼠右颈内动脉注射。24
肿瘤中Delta-24-RGD的检测
电镀24小时后，BM-hMSCs (106)以50 MOIs感染Delta-24-RGD 1小时。感染24小时后，用胰蛋白酶化方法离心收集脑基质hmscs。重悬的脑基质hmscs (5 × 104)被镀在Lab-Tek室载玻片上(赛默飞世尔科学生命科学公司)。感染48小时后，用2%多聚甲醛在室温下固定10分钟，5%牛血清白蛋白处理，然后用以下抗体染色检测Delta-24-RGD:小鼠抗hexon(1:500稀释，Santa Cruz Biotechnology)和兔抗e1a(1:400稀释，Santa Cruz Biotechnology)抗体。一抗在4℃孵育过夜。根据制造商的方案，使用Vectastain ABC-HRP试剂盒(Vector Laboratories)进行免疫组化分析。
肿瘤中BM-hMSCs的检测与定量
注射gfp转导的BM-hMSCs 3天后，通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)和4%多聚甲醛心内灌注人道地杀死小鼠。取出他们的大脑，在10%的福尔马林中固定24小时，用石蜡包埋，切成5 μm的切片。对于gfp标记的BM-hMSCs免疫荧光，石蜡切片用兔抗gfp抗体(1:200稀释，Abcam)染色。根据制造商的方案，使用Alexa Fluor 488偶联二抗(1:200稀释，Invitrogen)进行免疫荧光检测。用H & E染色或4 '，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚染色(vectasshield H-1200, Vector Laboratories)观察肿瘤。
在每个切片中勾画出肿瘤轮廓，并使用Olympus cellSens成像程序1.15版(Olympus Scientific Solutions Americas Inc.)确定肿瘤区域。用荧光显微镜(40×)计数肿瘤区gfp阳性细胞数;每毫米的细胞数2计算每个切片的肿瘤面积，并在所有切片中取平均值。
生物荧光成像
携带U87MG-LucNeo细胞的小鼠腹腔注射4 mg d -荧光素，并用IVIS-200系统(Xenogen Corp.)成像。使用Living Image 3.0软件(Xenogen Corp.)将生物发光图像叠加在灰度摄影图像上。
统计分析
细胞计数以每个实验至少3次重复测定的平均值±标准差表示。比较采用单因素方差分析。生存曲线比较采用log-rank检验。使用GraphPad Prism 6.05进行分析。p值< 0.05为有统计学意义。
结果
脑胶质瘤患者骨髓基质干细胞的来源
5例高级别胶质瘤复发患者，包括胶质瘤、间变性星形细胞瘤、GBM和间变性少突胶质瘤(表1)．所有患者均在全身麻醉下进行了成功的髂骨抽吸。从他们最后一次化疗到细胞收获的时间从2个月到18年不等，在细胞收获时检查他们的血细胞计数时，没有患者有骨髓抑制的证据。使用分离BM-hMSCs的方案，从所有5名患者的抽吸物中成功培养细胞作为贴壁培养物，如中所述开云体育世界杯赔率．从健康男性供体的抽吸物中提取的细胞也用同样的方法培养。开云体育世界杯赔率
脑基质hmscs的特征
所有5例患者的细胞都被分离出来，并进行大规模培养。与ISCT对bmm - hmscs的定义一致20.由于健康供体的骨髓基质干细胞(HD-BM-hMSCs)的特征，所有5例患者的贴壁细胞均表现出成纤维细胞样形态，并在第3代形成均匀的集落(图1一个)．对第3和第4传代的细胞进行典型BM-hMSCs标记的表达检测。流式细胞术显示，所有5个细胞系中超过97%的细胞表达CD105、CD73和CD90, CD34、CD45和CD11b均为阴性(表2)，与BM-hMSCs的表面标记特征一致。此外，所有5个细胞系都在不同的培养条件下进行了脂肪生成、成骨和软骨生成，并分别成功分化为脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞(图1 b)．这些结果共同表明，这些细胞符合脑转移- hmscs的组织学、表面标记物和分化标准，因此被称为“患者来源的脑转移- hmscs”(PD-BM-hMSCs)。
脑基质hmscs的特征。答:5个不同患者的细胞形态特征。与健康供体的细胞(HD-BM-hMSCs)相似，所有这些细胞都表现出成纤维细胞样形态，并在传代3时形成均匀的集落。原始放大×100。B:bmm - hmscs的分化。5株PD-BM-hMSC细胞系均能成功分化为脂肪细胞、成骨细胞或软骨细胞。对于成骨和成脂分化，倒置显微镜原始放大×100。直立亮场显微镜下，bar = 100 μm用于软骨分化。
PD-BM-hMSC系细胞表面标志物的流式细胞分析
| msc | CD105 | CD73 | CD90 | CD105/73/90 | CD45 | CD34 | CD11b |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| pd - bm - msc - 001 | 99.4 | 99.8 | 99.2 | 98.7 | 0 | 0 | 0 |
| pd - bm - msc - 002 | 99.7 | 99.9 | 99.4 | 98.8 | 0.12 | 0 | 0 |
| pd - bm - msc - 003 | 99.5 | 99.8 | 99.2 | 97.1 | 0.46 | 0 | 0 |
| pd - bm - msc - 004 | 99.1 | 99.9 | 99.8 | 98.6 | 0.22 | 0 | 0 |
| pd - bm - msc - 005 | 99.5 | 99.9 | 99.6 | 98.6 | 0 | 0 | 0 |
Delta-24-RGD在PD-BM-hMSCs中的体外感染和复制
探索Delta-24-RGD在PD-BM-hMSCs中感染和复制的能力。在感染50个Delta-24-RGD MOIs 48小时后，用免疫组化方法分析PD-BM-hMSCs中腺病毒E1A和六酮蛋白(图2一个)．只有在感染Delta-24-RGD后，E1A和hexon的病毒蛋白才有表达。电子显微镜显示病毒在PD-BM-hMSCs内复制(图2 b)．24小时后在细胞核中观察到病毒粒子，48小时后在包涵体周围的细胞质中观察到病毒粒子。
Delta-24-RGD在PD-BM-hMSCs内的体外感染和复制答:PD-BM-hMSCs中可见病毒E1A和六元蛋白。PD-BM-hMSCs用Delta-24-RGD (50 MOIs, 1小时)感染，胰酶化，并在腔室载玻片上重复，如中所述开云体育世界杯赔率．感染48小时后，用抗e1a或抗六酮抗体对载玻片进行免疫染色。具有代表性的PD-BM-hMSCs，即PD-BM-MSC-001，在细胞中显示病毒E1A蛋白和六元蛋白。B:代表性的电子显微照片显示PD-BM-MSC-001中有病毒复制。PD-BM-hMSCs在50个MOIs感染Delta-24-RGD，并在感染后24和48小时进行检查，如图所示。24小时后在细胞核和包涵体周围的细胞质中可见病毒粒子(箭头) 48小时后。H =小时。
体外药效试验
为了评估负载Delta-24-RGD (PD-BM-MSC-D24)的PD-BM-hMSCs释放、感染和溶解人胶质瘤的能力，进行了体外Transwell呼气。PD-BM-MSC-D24细胞在上孔中以增加剂量放置(102-10年5细胞/孔)和U87MG细胞(104)被放置在较低的井中。未感染Delta-24-RGD的PD-BM-hMSCs (mock)作为对照。7天后对U87MG细胞活力的定量分析表明，PD-BM-hMSCs释放出能够以剂量依赖方式感染和杀死U87MG细胞的活性Delta-24-RGD (图3)，在所有PD-BM-MSC-D24细胞系中均观察到。
Transwell化验。PD-BM-hMSCs在50个MOIs感染Delta-24-RGD，然后在Transwell板的上孔中以不同数量的细胞/孔(从10个不等)清洗和镀2到105单元格)，如图所示。U87MG细胞镀于底孔(104每孔培养细胞)，孵育7天，计数。所有PD-BM-MSC-D24细胞系均以剂量-反应方式杀伤。
颈动脉内输送后PD-BM-hMSCs定位于人胶质瘤
为了确定PD-BM-hMSCs在体内动脉内给药后选择性定位于人胶质瘤的程度，U87MG细胞(5 × 105)植入裸鼠额叶(每个PD-BM-hMSC n = 3)。用Ad5/F35-CMV-GFP转导PD-BM-hMSCs (50 MOIs)，并注射到右颈内动脉(106细胞/100 μl培养基)的小鼠移植7天。作为对照，将HD-BM-hMSCs注射入荷瘤小鼠(n = 3)， 3天后人道处死小鼠。H & E和抗gfp抗体免疫荧光染色显示5个PD-BM-hMSCs肿瘤内均有PD-BM-hMSCs (图4)．在大脑的其他部位几乎没有发现PD-BM-hMSCs。为了量化这些结果，每只小鼠至少计数5个组织切片，并确定每个肿瘤区域的PD-BM-hMSCs的数量。对5种PD-BM-hMSCs的分析显示，来自不同供体的PD-BM-hMSCs的归巢能力存在一些差异，但根据方差分析，这些PD-BM-hMSCs与HD-BM-hMSCs之间没有显著差异(p = 0.07，单向方差分析;图4 b)．这一结果表明，尽管先前暴露于化疗和放疗，PD-BM-hMSCs仍保持其神经胶质瘤的家园能力。
PD-BM-hMSCs在颈动脉内分娩后定位于人胶质瘤。答:代表性小鼠显微切片显示U87MG异种移植;GFP标记的PD-BM-MSC-001经颈动脉注射小鼠。第7天将100万个gfp标记的PD-BM-hMSCs注入右颈动脉，第10天取出小鼠大脑进行组织学检查。Bar = 500 μm (左)．免疫荧光显微镜用于追踪颈动脉内注射后PD-BM-hMSCs到U87MG异种移植的情况。切片后用fitc标记的抗gfp抗体免疫染色(绿色)．切片也用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。的盒装区域采用免疫荧光显微镜，使用抗gfp抗体研究PD-BM-hMSCs在肿瘤内的分布。Bar = 200 μm (正确的)．B:每个注射的PD-BM-hMSC细胞系U87MG异种移植中gfp阳性细胞的密度。细胞密度测定如中所述开云体育世界杯赔率．与HD-BM-hMSCs相比，PD-BM-hMSC细胞系间差异不显著(每个PD-BM-hMSC细胞系n = 3;p = 0.069，单因素方差分析)。
PD-BM-MSC-D24抑制异种移植物生长并提高存活率
然后，我们检查了PD-BM-MSC-D24在体内根除胶质瘤的有效程度。U87MG细胞移植(5 × 1054、18 d后，用PBS、PD-BM-MSC-004 (1.5 × 106细胞/100 μl)或PD-BM-MSC-004 (PD-BM-MSC-004- d24;1.5 × 106细胞/100 μl经颈内动脉注射(补充图2A)．另一组小鼠(n = 10)接受两次直接瘤内注射Delta-24-RGD (108植入后第4、8天的PFU (补充图2B)．生存分析显示，从PBS治疗后34天到PD-BM-MSC-004-D24治疗后45天的中位生存期有显著改善，PD-BM-MSC-004-D24治疗的小鼠中有40%长期存活(> 100天)，而PBS治疗后为0% (p < 0.05, log-rank检验;图5)．PD-BM-MSC-004- d24治疗与PD-BM-MSC-004(未感染)治疗相比生存率提高，尽管两者之间的差异没有达到显著性，因为PD-BM-MSC-004组中有一个异常值(p = 0.05)。PD-BM-MSC-004-D24注射组与两次直接注射Delta-24-RGD组生存率无显著差异(p = 0.66)。
PD-BM-MSC-D24抑制异种移植生长并提高生存率。裸鼠植入U87MG的两个独立实验对应的生存数据(一个)及U87MG-LucNeo (B)．在每个实验中，小鼠动脉内注射PBS，未感染的PD-BM-hMSCs (1.5 × 106PD-BM-MSC-004 [A]或PD-BM-MSC-001 [B])或PD-BM-MSC-D24 (1.5 × 10650 MOIs × 24小时，PD-BM-MSC-004-D24 [A]或PD-BM-MSC-001-D24 [B])。一组小鼠接受两次直接瘤内注射Delta-24-RGD (108空斑形成单位)。N = 10只/组。使用供体004 (A)的细胞，PD-BM-MSC-004- d24处理小鼠的中位生存时间为45天，PBS对照组为34天，未感染的PD-BM-MSC-004小鼠为31.5天。PD-BM-MSC-004-D24治疗后，40%的动物长期存活(> 100天)。使用供体001 (B)的细胞，PD-BM-MSC-001- d24处理小鼠的中位生存时间为77.5天，而PBS对照组为51天，未感染PD-BM-MSC-001的小鼠为49天。PD-BM-MSC-001-D24治疗后，30%的动物长期存活(> 100天)。PD-BM-MSC-001异种移植的光子通量(C)．总光子通量测量从固定的感兴趣的区域，包括整个老鼠头。每一个行代表单个动物的流出。PD-BM-MSC-001-D24治疗和瘤内注射治疗的生长较慢。存活数据(D)使用临床级健康供体间充质干细胞(HD-BM-hMSCs)和临床级Delta-24-RGD (DNX2401)，其中裸鼠植入U87MG。HD-BM-hMSC-DNX2401处理小鼠的中位生存时间为86天，PBS对照组为33天，未感染HD-BM-hMSCs的小鼠为33天(HD-BM-hMSCs组n = 9只小鼠，HD-BM-hMSC-DNX2401组n = 8只小鼠，其他各组n = 10只小鼠/组)。D24-RGD = Delta-24-RGD;肿瘤内注射;不显著。*p < 0.05， **p < 0.01, log-rank检验。
使用不同的PD-BM-hMSCs (PD-BM-MSC-001;图5 b)．此外，本实验利用U87MG-LucNeo细胞进行生物发光跟踪肿瘤生长。简单地说，U87MG-LucNeo细胞被植入(5 × 1054 d和18 d后，用PBS、PD-BM-MSC-001 (1.5 × 106/100 μl)或PD-BM-MSC-001-D24 (1.5 × 106细胞/100 μl)经颈动脉注射。生存分析显示，中位生存期从51天显著改善至77.5天(p < 0.01;图5 b)， 30%的PD-BM-MSC-001-D24治疗小鼠长期存活(> 100天)，而PBS治疗后为0%。PD-BM-MSC-001- d24治疗与PD-BM-MSC-001(未感染)治疗相比生存率提高，尽管两者之间的差异没有达到显著性，因为PD-BM-MSC-001组中有一个异常值(p = 0.08)。PD-BM-MSC-001-D24注射组与直接注射Delta-24-RGD组生存率无显著差异(p = 0.39)。生物发光成像显示各组间光子通量在4周时有显著差异(补充图3)．总光子通量测量从固定的感兴趣的区域，包括整个老鼠头。定量分析显示，与其他组相比，PD-BM-MSC-D24和Delta-24-RGD直接注射组的动物生长速度较慢(图5度)．
为了对PD-BM-hMSCs与HD-BM-hMSCs进行比较，采用临床良好生产规范等级HD-BM-hMSCs和临床等级Delta-24-RGD (DNX2401;HD-BM-hMSCs组n = 9只，HD-BM-hMSC-DNX2401组n = 8只，其他各组n = 10只/组)。生存分析显示，中位生存期从PBS治疗后33天显著改善至HD-BM-hMSC-DNX2401治疗后86天(p < 0.01;图5 d)．此外，注射未感染HD-BM-hMSCs的患者与注射HD-BM-hMSC-DNX2401的患者之间存在显著差异(p = 0.02)。有趣的是，在未感染的HD-BM-hMSCs组中有一个异常值，这与pd - bm - hmscs - d24生存研究中观察到的异常值相似(图5而且B)．将使用HD-BM-hMSCs(来自健康供体)的这些结果与使用先前接受过放疗和化疗的患者的PD-BM-hMSCs的独立实验结果进行比较(图5而且B)，我们注意到PD-BM-hMSCs与HD-BM-hMSCs表现相似。
讨论
在这里，我们表明，可以成功地从复发性高级别胶质瘤患者中分离出BM- hmscs，这些患者之前曾接受过放射治疗和化疗，这些治疗可导致BM毒性。在连续5例病例中，这些PD-BM-hMSCs与健康供体的PD-BM-hMSCs相似，在形态、表面标志物和分化能力方面均符合基于ISCT标准的BM-hMSCs定义。PD-BM-hMSCs易于在体外扩增，并在动脉注射后有效地定向到小鼠颅内胶质瘤异种移植。重要的是，PD-BM-MSC-D24能够在体外和体内根除人类胶质瘤，与临床级HD-BM-hMSCs一样有效。具体来说，在U87MG胶质瘤小鼠颈动脉内注射两次PD-BM-MSC-D24后，与对照组相比，生存率显著提高。
我们和其他人已经探索了使用各种类型的细胞作为溶瘤病毒的载体，包括HD-BM-hMSCs、神经干细胞和T细胞。25要成为溶瘤病毒的合适细胞载体，必须满足以下几个条件:1)病毒必须能够感染细胞载体;2)病毒复制和释放的动力学必须是有利的;3)细胞载体必须能够从注射部位移动到肿瘤部位。本研究证明Delta-24-RGD在PD-BM-hMSCs中感染和复制，PD-BM-hMSCs有效地将Delta-24-RGD传递到肿瘤，感染和释放动力学有利于肿瘤根除。因此，我们的研究支持了这样的观点，即从接受过放疗和化疗的患者中获得的BM-hMSCs(即PD-BM-hMSCs)能够向恶性胶质瘤传递功能性Delta-24-RGD。
最初，异体间充质干细胞被用于转化和临床研究11因为从健康捐赠者那里获取开云体育世界杯赔率msc的方法已经很成熟了。此外，已知BM-hMSCs在细胞表面表达低水平的主要组织相容性复合体I类分子，而不表达主要组织相容性复合体II类抗原。26然而，最近的一项研究表明，hMSCs可能没有免疫特权。16因此，使用自体骨髓间充质干细胞在避免不利的免疫反应方面具有优势。目前，一些临床试验已经评估或正在评估来自骨髓或其他来源的自体hMSCs作为溶瘤病毒携带者。例如，Mayo诊所(首席研究员E. Galanis，医学博士)正在进行一项I/II期试验，以确定使用脂肪组织来源的自体hMSCs感染溶瘤麻疹病毒治疗复发性卵巢癌患者的安全性、剂量和临床效果(clinicaltrials.gov标识符NCT02068794)。然而，关于BM-hMSCs是否可以从接受放化疗的患者身上获得，以及这些hMSCs是否保留靶向溶瘤病毒并向脑肿瘤输送溶瘤病毒的能力，仍然存在问题。在这里，我们已经证明了从接受过毒性化疗的高级别胶质瘤患者中获得脑转移瘤- hmscs的可行性。虽然在我们的队列中，从最后一次化疗到BM-hMSCs收获的时间从2个月到18年不等，但与HD-BM-hMSCs相比，所有PD-BM-hMSCs在体外加载和释放Delta-24-RGD以及在体内返回脑肿瘤的能力相似。此外，即使在替莫唑胺化疗后仅2个月就分离出PD-BM-MSC-001细胞，它们也能够进行数值扩增，并且PD-BM-MSC-001- d24细胞在体外和体内都保留了杀死人胶质瘤细胞的能力。
通过生物发光成像分析肿瘤大小，瘤内注射裸DNX2401(不含BM-hMSCs)似乎优于动脉注射装载DNX2401的BM-MSCs (图5度)，尽管在动物存活率方面没有显著差异(图5 d)．对这种差异的一个可能的解释是，瘤内注射组在肿瘤植入后第4天和第8天进行注射，而动脉注射组在第4天和第18天进行治疗，并延迟第二次注射，以使肿瘤植入后更大程度的血管化。我们认为，在本实验中，基于生物发光分析，肿瘤内注射最初表现得比动脉内注射更好，因为在治疗时，瘤内注射组的肿瘤比动脉内注射组的肿瘤更小。两组的生存曲线几乎相同，因为第18天动脉内注射有效地减小了较大肿瘤的大小。在临床环境中，我们的研究支持使用这两种策略，可以想象，较小的肿瘤可以通过直接瘤内注射治疗，而动脉内注射可能最适合于较大的肿瘤。
有趣的是，在我们的每一项体内疗效实验中，BM-hMSC组中至少有1只动物(无Delta-24-RGD)长期存活。在一项实验中，生物发光分析显示肿瘤消失后信号消失，但组织学研究显示肿瘤已被纤维化块取代。这些结果表明，有时BM-hMSCs可能能够诱导肿瘤细胞转分化为成纤维细胞。虽然这一现象还需要进一步研究，但Delta-24-RGD加载到MSCs时并未观察到。PD-BM-MSC-D24和HD-BM-MSC-D24细胞都能完全根除人类胶质瘤。
结论
我们的研究结果证实，来自高级别胶质瘤患者的BM-hMSCs (PD-BM-hMSCs)可以装载Delta-24-RGD，并可用于治疗GBM患者。本研究为今后利用自体PD-BM-hMSCs通过动脉注射将Delta-24-RGD递送至脑肿瘤部位的临床研究奠定了基础。
致谢
我们非常感谢科学出版物部门的Ann Sutton和德克萨斯大学MD Anderson癌症中心神经外科部门的David Wildrick博士的编辑协助。开云体育app官方网站下载入口
这项研究得到了美国国家癌症研究所(资助号:1R01CA214749、1R01CA247970、P30CA016672和2P50CA127001)、德克萨斯大学MD Anderson Moon Shots项目、Broach脑癌研究基金会、Elias家族基金、Priscilla和Jason Hiley基金、Baumann家族/CureFest基金、Jim和Pam Harris基金、Gene Pennebaker脑癌基金、Schneider纪念癌症研究基金、Sweet家族癌症研究基金、玛妮·罗斯博士基金会、戈尔德家族纪念基金和索伦森基金会(全部捐给f.l.)。
披露的信息
Drs。Lang、Fueyo和Gomez-Manzano是Delta-24-RGD的专利持有人，该专利已授权给DNATrix, Inc.。Drs。Fueyo和Gomez-Manzano是DNATrix公司的顾问，从DNATrix公司收取版税，并持有专利。Lang博士持有DNATrix, Inc.的专利。
作者的贡献
构思与设计:清水、古民。数据采集:Shimizu, Gumin, Gao, Yang, Ledbetter。数据分析和解释:Shimizu, Gumin, Hossain。文章起草人:Lang, Shimizu, Hossain, Kondo, Parker Kerrigan。对文章进行批判性修改:Lang, Parker Kerrigan。审查提交的手稿版本:Lang, Shpall, Kondo, Parker Kerrigan, Yang, Ledbetter, Fueyo, Gomez-Manzano。审定稿稿代表所有作者:朗。行政/技术/物质支持:Gumin, Shpall, Fueyo, Gomez-Manzano。
补充信息
之前的演讲
这些数据之前曾作为海报在2018年11月15日至18日在路易斯安那州新奥尔良举行的神经肿瘤学会第23届年会和教育日上展示过。
