B雨动静脉畸形(BAVM)导致血液直接从供血动脉分流到引流静脉，是一种罕见的脑血管病变，大约发生在0.01%的人群中。1，2BAVM患者经历许多神经系统后果，包括头痛、癫痫、功能障碍和危及生命的脑出血(ICH)。3 - 5然而，BAVM发生的机制在很大程度上仍然未知，目前还没有有效的药物治疗来干预BAVM的发生或预防破裂。介入治疗方案，如显微手术切除、栓塞和放射手术，并不总是可行的，并可能导致并发症或残疾。6 - 9更好地了解BAVM的发展和ICH的危险因素对于开发新的治疗方法和改善结果至关重要。
散发性BAVM的发病机制一直被怀疑与体细胞突变有关，这是基于对许多其他血管异常的观察，这些异常的特征是单独或与种系突变结合的体细胞突变。10 - 15最近，体细胞激活突变喀斯特MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的一个基因，在大多数散发性BAVM病变中均有报道，16这个发现也得到了其他研究的证实。17-21鉴于在其他血管异常中已经报道了其他几个MAPK通路基因的体细胞突变，12，22 - 24我们假设多个MAPK通路基因的体细胞突变可能有助于BAVM的病因学或临床表型。
我们对14例散发性BAVM患者的配对BAVM组织和血液DNA样本进行了全外显子组测序(WES)，并评估了MAPK信号通路中的295个基因，以确定那些在BAVM病变中存在躯体突变的基因。两者的探测喀斯特最近在BAVM患者中报道的突变(G12V和G12D)月16日用于设计一个改进的管道，以检测MAPK通路中的其他候选体细胞变异并对其进行优先级排序。最后，我们评估了躯体疾病的患病率和相关性喀斯特伴有三种临床表型的BAVM突变:病变大小(最大直径)、诊断年龄和脑出血年龄。
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研究群体
所有患者在2002年至2017年期间前瞻性入选加州大学旧金山分校(UCSF) BAVM项目，无BAVM家族史、遗传性出血性毛细血管扩张症或其他已知遗传综合征。经导管血管造影和/或病理评估确诊为BAVM。遗传研究获得知情同意，该研究得到了加州大学旧金山分校人类研究委员会的批准。
在发现队列中，我们分析了14例诊断为散发性BAVM的白人患者的数据，这些患者的BAVM组织已在最佳切割温度(OCT)化合物中冷冻，并可用于分析血液。除1例首次治疗为栓塞外，所有接受显微手术切除BAVM的患者均未接受过介入治疗。患者在性别和BAVMs破裂和未破裂方面平均分布。所有患者都是白人，UCSF BAVM队列中最常见的种族/民族，以减少由于遗传差异造成的混淆。
在复制队列中，我们分析了另外56例散发性BAVM患者，其中8例在显微外科切除术前接受了栓塞治疗，1例在显微外科切除术前接受了放射治疗。复制队列包括具有完整临床数据和足够oct冷冻组织用于分析的BAVM患者。因此，复制队列包括了多种族背景的患者，更能代表整个UCSF BAVM项目队列中的患者。
在整个队列中纳入的70例患者中，43例患有脑出血。所有患者的人口统计学和表型数据显示在补充表1．
DNA提取
血液基因组DNA以前是用标准的DNA提取技术分离和储存的。对于BAVM组织，切除后的样本在液氮中快速冷冻，并在- 80°C的OCT化合物中保存。冷冻组织批量冷冻切片，用DNeasy血液和组织试剂盒(QIAGEN)分离基因组DNA。
WES文库的制备和测序
我们使用Nextera快速捕获外显子组试剂盒(Illumina)进行外显子组富集和文库制备，每个样品含有250ng DNA。配对端测序(2 × 76 bp)在马萨诸塞州剑桥市Broad研究所的Illumina HiSeq 2500平台上进行。
体细胞变异调用和后续过滤
用Burrows-Wheeler比对工具将测序结果映射到人类参考基因组组装(hg19)，25然后根据基因组分析工具包(GATK)的最佳实践工作流程进行预处理，以发现体细胞短变体。26，27GATK 3.6版本中的Mutect2用于调用默认参数的体细胞单核苷酸变体(snv)。我们设计了一个定制的工作流程，优先考虑与BAVM相关的候选体细胞变体，并按顺序应用过滤器(补充图1而且补充表2)．因为两者的TLOD(概率的对数)值(即调用肿瘤变异的初始LOD阈值)喀斯特突变(G12V和G12D)大于4.2，我们使用TLOD≥4.2作为第一过滤器。最后,SnpEff28和PolyPhen-229(HumDiv-trained)分别用于变体标注和功能效果预测。被预测“可能具有破坏性”的变异被保留了下来。
突变背景评估
我们应用了MutSigCV30.和MUFFINN31以识别与BAVM相关的突变基因。因为MutSigCV需要沉默和非沉默变异来评估背景突变率，我们使用了通过分析前四个过滤器的12,272个snv (补充图1)．Oncotator32用于生成MutSigCV所需的输入突变文件。对于MUFFINN，我们使用了通过所有分析过滤器的3624个snv (补充图1)、网络算法NDsum、功能网络HumanNet。
测序覆盖率评估
我们使用了ExomeCQA33为了评估研究队列中测序reads的覆盖率分布，我们使用床工具计算所需的覆盖率文件。队列覆盖率稀疏性用于评估整个基因组中所有外显子的覆盖率，不均衡性用于评估给定外显子在所有样本中的覆盖率。
数字液滴聚合酶链反应
为了验证和复制，我们进行了分析喀斯特根据制造商的说明(Bio-Rad唯一检测ID dHsaCP2000005用于突变体G12V, dHsaCP2000001用于突变体G12D, dHsaCP2000006用于野生型G12V, dHsaCP2000002用于野生型G12D)，使用市上可用的数字液滴聚合酶链式反应(ddPCR)检测G12V和G12D。采用QX100 ddPCR系统(Bio-Rad)进行液滴生成和数据采集。每次反应共使用40 ng DNA，最大灵敏度为0.025%。我们包括阳性对照(体细胞突变阳性)、阴性对照(仅野生型)和所有模板的非模板对照。数据分析包括用Bio-Rad QuantaSoft analysis Pro软件测定等位基因负担。所有试验均重复或重复进行。此外，我们要求每个患者至少有250个信号阳性液滴，每口井至少有100个信号阳性液滴。
统计分析
如果G12D和G12V的ddPCR检测均通过质量控制，我们将样本纳入统计分析。我们以数值变量的均值±标准差(SD)或类别变量的计数和百分比来计算患者和BAVM特征的汇总统计数据。在我们的初步分析中，我们测试了G12D或G12V等位基因的百分比是否与三个结果相关:1)组织收集时的年龄;2) BAVM病变大小(最大病变直径毫米);3)初次脑出血年龄。对于结果1和2，我们使用线性回归模型，对性别和既往ICH进行调整，并报告指数回归系数或比例增加(PI)， 95%置信区间(ci)。对于结果3，我们使用Cox比例风险模型，根据性别和BAVM大小进行调整，并报告风险比(HR)和95% CI;收集组织时未发生脑出血的患者被切除。二次分析分别评估了G12D和G12V等位基因负担的百分比，我们还根据存在或不存在任何一种体细胞突变(等位基因负担阈值为0.5%)对患者进行了分类。数据分析采用Stata版本15.1 (StataCorp LLC)进行。
结果
WES数据和读覆盖
对BAVM病变和血液DNA样本分别产生1.23亿和1.19亿读数。病变和血液DNA样本的平均读数分别为99.04%和98.80%。病变DNA的平均(范围)测序覆盖率为108× (88× ~ 142×)，血液DNA的平均(范围)测序覆盖率为97× (70× ~ 125×)补充表3)．我们观察到所有样本的覆盖率存在差异(补充表3)和每个样本的目标区域(数据未显示)。
MAPK通路中bavm相关候选体细胞变异的鉴定
在外显子体范围内共鉴定出37591个体细胞变异(通过使用Mutect2的默认参数)。应用顺序滤镜后(补充图1)，最终候选体细胞变异数减少至3624个。我们交叉引用了295个MAPK通路基因的候选体细胞突变列表(包括在京都基因和基因组百科全书数据库中，https://www.genome.jp/kegg/)．喀斯特是我们研究中观察到的唯一一个反复突变的MAPK通路基因(G12V) (图1)．另外还有10个MAPK通路基因具有候选体细胞变异，每个变异仅适用于1个患者(图1)．在这10个MAPK基因中共鉴定出22个“可能具有破坏性”(PolyPhen2)变异(每个基因2或3个变异)(图2)．仅有1个变异的等位基因频率大于6%。
纳入发现队列的散发型BAVM患者的体细胞变异等位基因负担(%)。的喀斯特G12V突变是该队列中唯一复发的体细胞突变，显示在第一行，其次是> 1患者中包含候选体细胞突变的10个MAPK途径基因。所有结果均由WES获得(n = 14)。
MAPK通路基因与候选bavm相关体细胞变异的突变格局上:发现队列中包含的散发性BAVM患者的每兆酶外显子范围的体细胞突变率(n = 14)。低:确定每个患者的候选体细胞变异和表型信息(性别、BAVM病变大小和年龄组)。
喀斯特G12V和G12D突变
这两个人之前都有复发的报道喀斯特突变月16日在两个不同的BAVM样品中使用Mutect2进行识别。的喀斯特G12V突变是通过所有筛选的最后一组变异之一，在我们的分析中被确定为复发突变。的喀斯特G12D突变被预测为“可能具有破坏性”，并通过功能效应预测分析过滤掉。当我们在不使用任何过滤器的情况下计算包含这些突变的测序reads的数量时，在14例患者中有3例发现了G12V，在5例患者中发现了G12D (图3而且B）;所有阳性结果随后用ddPCR (图3 e而且F)．没有样本两种检测结果都呈阳性喀斯特突变。这两个喀斯特在任何血液样本中都未检测到突变。未发现其他候选体细胞突变喀斯特．
识别和验证喀斯特14例BAVM患者经WES和ddPCR检测发现G12V和G12D突变。A, c, e:的等位频率(%)喀斯特在发现队列中的14例BAVM患者中出现G12V突变。B d f:的等位频率(%)喀斯特G12D突变。A和B:无过滤WES得到的结果。C和D:用WES和Mutect2分析得到的结果。E和F:ddPCR检测结果。
背景突变率的评价
我们应用了MutSigCV和MUFFINN两种不同的方法来评估候选基因中已识别的体细胞突变率是否高于预期的背景突变率。在外显子体范围内，共有218个基因被鉴定为MutSigCV显著突变(p < 0.1)。其中6个是MAPK信号通路基因(Atf2, crkl, dusp6, kras, PDGFB,PDGFRB)．喀斯特MAPK通路基因为唯一反复发生体细胞突变的基因，而CRKL而且PDGFRB至少有两个病人有不同的突变。
通过使用MUFFINN，我们根据候选突变的数量和已知的功能网络信息给458个基因分配了一个分数。其中11个是MAPK通路基因，包括喀斯特所有的基因都列在图1．总的来说,喀斯特,CRKL,PDGFRB是根据MutSigCV和MUFFINN鉴定的唯一具有与BAVM相关的候选体细胞变异的MAPK途径基因。在所有MAPK通路基因中，喀斯特而且PDGFRB是含有bavm相关变异的前两个候选基因。MutSigCV分析确定喀斯特作为突变最显著的基因，其次是PDGFRB；MUFFINN分析的最高分为PDGFRB，然后是喀斯特．
躯体协会喀斯特BAVM临床表型突变
结合发现队列和复制队列，我们使用ddPCR进行检测喀斯特69例BAVM病变标本和32例配对血液标本(补充表1)．69个样本中有56个(81%)通过了质量控制并被纳入统计分析。收集组织时的平均年龄±SD为37.1±17.7岁，其中28例(50%)为女性。平均BAVM直径为19.2±10.7 mm。35例(63%)患者在切除前发生脑出血，平均年龄为35.7±19.7岁。在31份(55%)BAVM DNA样本和0份血液DNA样本中检测到G12V或G12D体细胞突变。体细胞突变的等位基因负担喀斯特18个(32%)BAVM样品中G12D或G12V超过0.5%;检测到的最高水平为5.0%。
我们评估了体细胞等位基因负担之间的相关性喀斯特突变和BAVM严重程度的三种表型:切除时的年龄、病灶大小(最大直径)和首次脑出血的年龄(表1)．我们没有发现肉体上的联系喀斯特突变量与BAVM切除时的年龄(PI 0.7 [95% CI -2.9至4.3]，p = 0.69)， BAVM大小(PI 1.4 [95% CI 0.7 - 3.6]， p = 0.18)，或首次颅内出血时的年龄(HR 0.87 [95% CI 0.64-1.20]， p = 0.40)。个体G12V或G12D突变负担，或每种突变的存在，也与任何BAVM表型无显著相关性(表1)．
体细胞KRAS突变的等位基因负担与BAVM严重程度的三种表型之间的关联
| 喀斯特突变 | 不。的患者 | 组织采集年龄＊ | BAVM大小＊ | 初诊年龄__ | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 系数(95% CI) | p值 | 系数(95% CI) | p值 | Hr (95% ci) | p值 | ||
| G12D或G12V | |||||||
| 等位基因负担% | 56 | 0.7(−2.9 ~ 4.3) | 0.69 | 1.4(−0.7 ~ 3.6) | 0.18 | 0.87 (0.64 - -1.20) | 0.40 |
| 存在 | 56 | 1.3(−8.9 ~ 11.4) | 0.80 | 3.2(−2.8 ~ 9.2) | 0.29 | 0.77 (0.35 - -1.72) | 0.53 |
| G12D | |||||||
| 等位基因负担% | 57 | 2.4(−2.6 ~ 7.3) | 0.35 | 1.6(−1.4 ~ 4.5) | 0.30 | 0.95 (0.67 - -1.34) | 0.76 |
| 存在 | 57 | 1.6(−9.5 ~ 12.7) | 0.77 | 2.4(−4.2 ~ 9.0) | 0.47 | 0.90 (0.39 - -2.06) | 0.80 |
| G12V | |||||||
| 等位基因负担% | 65 | −0.6(−5.1 ~ 4.0) | 0.80 | 0.9(−1.6 ~ 3.4) | 0.48 | 0.87 (0.56 - -1.35) | 0.53 |
| 存在 | 65 | 0.4(−17.1 ~ 17.9) | 0.97 | 3.0(−6.6 ~ 12.5) | 0.54 | 0.68 (0.16 - -2.96) | 0.61 |
线性回归模型的结果，调整性别和既往ICH。
Cox比例风险模型的结果，根据性别和BAVM大小进行了调整。在收集组织时未发生脑出血的患者被切除。
讨论
我们使用WES对14例BAVM患者的病变和血液DNA样本进行了配对评估，以确定295个MAPK通路基因的体细胞突变。两个喀斯特在最近的研究中，与BAVM相关的突变(G12V和G12D)也在我们的研究队列中被发现，并在更大的队列中用ddPCR进一步验证。通过使用这两个突变作为标准，并应用严格的过滤器管道，我们在其他10个MAPK通路基因中鉴定出了候选的bavm相关体细胞突变。
喀斯特BAVM患者的突变
总的来说,喀斯特至少在7个BAVM队列中发现了突变(G12V和G12D)，月16日包括我们的，这是迄今为止发表的最大的队列之一。尼古拉耶夫等人。16首次报道了60%的散发性BAVM患者携带这些病毒喀斯特而Hong等人。17报告90%的患者有阳性结果喀斯特突变。在我们的研究中，我们发现了体细胞喀斯特43%的BAVMs患者发生突变。我们研究中较低的百分比可能部分原因是我们WES数据的测序覆盖率(70×)较其他研究(> 1000×)低17或300×16)．然而，报道的等位基因负担的体细胞喀斯特包括我们的研究在内，所有研究中的突变相似(高达约5%)。多项研究中一个有趣的观察结果是，在更多的BAVM患者中发现了G12D，但G12V的平均等位基因负担(2.01%)高于G12D(1.14%)。这说明等位基因负担较低喀斯特与G12V相比，G12D突变可能足以产生BAVM表型，并且G12D可能在脑血管环境中对KRAS蛋白具有更强的功能影响。这些功能研究喀斯特突变(主要发生在上皮癌细胞系)表明了这一点喀斯特G12V和G12D突变可能对增殖、选择和下游信号传导有不同的影响。34，35
在迄今为止进行的7项关于散发性BAVM的研究中，喀斯特是唯一一个反复出现体细胞突变的基因。17-21这意味着喀斯特可能在BAVM的病因学中起重要作用，并可能是大多数散发性BAVM患者的潜在治疗靶点。喀斯特突变常见于多种癌症(包括结直肠癌、胰腺癌和肺癌)患者36)和其他与血管生成相关的疾病，如子宫内膜异位症。37
我们还评估了体细胞之间的联系喀斯特突变(等位基因负担或存在)和我们假设的三种BAVM严重程度的表型(切除时的年龄、病灶大小或第一次出血时的年龄)可能受到体细胞突变负担的影响;然而，我们没有发现任何统计学上显著的相关性。缺乏相关性的一种潜在解释可能是在粗略冷冻切片的样本中，非病变细胞的不同存在引起混淆。可能需要更精确地评估BAVM病变细胞中的等位基因负担，以检测相关性:例如，BAVM病变的内皮细胞可能需要首先用激光捕获显微镜分离。缺乏统计学意义上的关联喀斯特突变等位基因负担和表型可能是由于精度低，因为95% ci是宽的(表1)．例如，收集组织时年龄的95% ci和存在突变的时间跨度都大于20年。
其他MAPK通路基因的候选bavm相关突变
我们确定了MAPK途径中其他10个具有候选体细胞突变的基因，这些基因存在于包括在发现队列中的多个患者中。在这其中,PDGFRA而且PDGFRB在血管生成和血管稳定方面有不同的作用。38PDGFRB这三个基因中的一个(和喀斯特而且CRKL)的候选体细胞突变被检测到的频率高于预期。BAVM的实验动物模型显示Pdgfr-β表达降低，39在BAVM血管和邻近的血管周围空间中观察到pdgfrb阳性周细胞覆盖率显著降低，这提示了在BAVM中破坏性体细胞突变的潜在机制PDGFRB可能有助于BAVM的发展。40最近,激活PDGFRB体细胞突变也在梭状(但不是囊状)脑动脉瘤中被发现，进一步支持在脑血管异常发展中的作用。41CRKL该基因是第三个在BAVM病变中有过多候选体细胞突变的基因，是一个假定的原癌基因，在多种类型的癌症中上调。42体外扩增CRKL在表皮生长因子受体-突变细胞通过激活ERK和AKT信号通路诱导耐药性，43而CRKL过表达促进细胞入侵通过上调MMP-9表达式。44
研究的局限性
这项研究有几个局限性。亚分割未用于分离BAVM病变细胞或内皮细胞，这可能减少了样本中突变DNA分子的数量。如前所述，我们原始WES测序数据集的测序覆盖率相对较低(70×，而其他研究为300×到> 1000×)16，17)降低了检测等位基因表达< 2%的候选突变的敏感性。我们还观察到不同样本的覆盖率差异(补充表2而且补充图2)和样本内目标区域的读取覆盖不均匀(数据未显示)，这些进一步降低了变体调用的检测和准确性。
BAVM的遗传异质性
BAVM是一种可能具有遗传异质性的复杂病变。在之前的所有研究中，以及我们的研究中，体细胞喀斯特并不是每个病人都有突变。我们在MAPK通路基因中发现了其他几个候选突变;在某些病例中，在单个患者中发现了多个基因的体细胞突变。尽管这些突变仍有待验证，但它们表明单个突变可能不足以诱导BAVM的形成，相反，可能需要对同一途径中的基因进行多次打击。这些基因命中可能来自其他机制，例如表观遗传失活，或者BAVM可能与其他基因和途径的畸变有关。这种观察到的遗传异质性最终表明，不同的患者可能需要不同的治疗方法以及可靠的生物标志物。在未来，患者样本的诊断测序(例如，通过无细胞DNA的靶向测序或病变细胞的血管内采样)45)可用于将患者亚组与适当的靶向治疗策略相匹配。
结论
我们的研究表明，BAVM表现出体细胞突变异质性，因为在BAVM病变中观察到MAPK途径基因的罕见体细胞突变的不同组合(但在血液DNA中没有)。在我们的研究中，我们重复了之前确定的两种高患病率喀斯特突变(G12V和G12D)，证实这两种突变是存在于BAVM组织中最普遍的体细胞突变。我们没有发现体细胞之间的显著联系喀斯特突变负荷和三种表型的BAVM严重程度，但可能需要更敏感的检测突变负荷。我们还发现了一些与散发性BAVM相关的新的候选体细胞突变，包括突变PDGFRB而且CRKL．需要对这些突变进行验证和功能研究，以阐明导致BAVM的生物学过程。
致谢
我们感谢患者及其家属参与我们的研究，感谢UCSF BAVM项目成员和脑血管研究中心的技术援助和研究支持。本项目部分由以下拨款支持:NIH NS034949和NS099268(授予H.K.)， NS070029 (L.P.)， NS027713和NS112819 (H.S.)， AHA 19POST34370066 (S.G.)，神经外科医生大会(b.p.w)和Michael Ryan Zodda基金会(H.S.)的Christopher C. Getch奖学金。
披露的信息
高博士获中国留学基金委资助。Walcott医生得到了Christopher C. Getch奖学金(神经外科医生协会)的支持。尼尔森先生从美国国立卫生研究院的拨款中获得工资支持。Hetts博士从Siemens、Stryker、MicroVention和Cerenovus获得非研究相关临床或研究工作的支持，并拥有Filtro Medical的股票。Kim博士接受NIH对所述研究(包括设备或材料)的临床或研究支持。
作者的贡献
构思与设计:Pawlikowska, Kim。数据获取:Pawlikowska, Gao, Winkler, Rutledge, Abla, Gupta, Cooke, Hetts, Tihan, Hess, Ko, Walcott, Lawton, Su, Kim。数据分析和解释:Pawlikowska, Gao, Weinsheimer, McCulloch, Kim。文章起草人:高。批判性地修改文章:Pawlikowska, Gao, Nelson, Weinsheimer, Shieh, McCulloch, Su, Kim。审稿版本:所有作者。代表所有作者批准了手稿的最终版本:Pawlikowska。统计分析:Nelson, McCulloch。行政/技术/物质支持:Abla, Gupta, Cooke, Hetts, Tihan。研究监督:Pawlikowska, Kim。
补充信息
之前的演讲
这项工作的部分内容作为海报(#2536)在2018年10月16日至20日在加利福尼亚州圣地亚哥举行的美国人类遗传学学会年会上展出(https://www.ashg.org/wp-content/uploads/2019/10/2018-poster-abstracts.pdf)．
当前的关系
拉特利奇博士:神经外科，巴罗神经研究所，凤凰城，亚利桑那开云体育app官方网站下载入口州。
